一、什麼是慢性粒細胞白血病？

慢性骨髓性白血病（chronic myelogenous (or myeloid) leukemia (CML)），又稱為慢性粒細胞白血病（chronic granulocytic leukemia (CGL)），是一種造血幹細胞克隆增生性疾病。臨床上根據其症狀可分為慢性期、加速期和急變期。其特點為由於骨髓幹細胞失常而導致的，髓細胞的加速且失控地增長，以及髓細胞在血液中的過度積累。其主要臨床表現為粒細胞（嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞）及其前體過量。

慢性粒細胞白血病在所有年齡階段都有發生，但在20～50歲人群中發病率較高。其年發病率為0.1~0.2%，男性發病率略高於女性，占成年白血病患者的15~20%。我國每年新增病例高達30000例。使用傳統治療，病人患病後1~1.5年內由慢性期進入加速期，3~6個月後，進入急變期並死亡，另外有20~25%的病人不經過加速期而直接進入急變期。病人平均存活時間為三年，少於20%的病人能存活五年以上。

二、Bcr-Abl癌基因是慢性粒細胞白血病的元凶

慢性粒細胞白血病的發病機製是9號染色體長臂與22號染色體長臂的異位。臨床上以費城染色體，即由於染色體異位而異常短小的9號染色體，為特征。由於此種異位，Bcr基因與Abl基因並置在一條染色體上形成Bcr-Abl（Breakpoint cluster region-Abelson leukemia）癌基因，其編碼產生了致癌的Bcr-Abl融合蛋白。這種Bcr-Abl融合蛋白是一種構成性激活的酪氨酸激酶，能導致細胞癌變。而Bcr-Abl激酶也成為了治療慢性粒細胞白血病小分子藥物的主要靶點，通過抑製其活性，可達到控製及改善慢性粒細胞白血病的目的。

三、人類發明治療慢性粒細胞白血病藥物的過程

由於隻作用於Bcr-Abl相關蛋白，Bcr-Abl激酶抑製劑以其療效顯著，副作用小的優點，成為慢性粒細胞性白血病的主要治療手段。目前已有伊馬替尼、尼羅替尼、達沙替尼、博舒替尼和普納替尼等五種Bcr-Abl激酶抑製劑上市。然而，隨著臨床應用的增加，部分患者對伊馬替尼產生了耐藥性。伊馬替尼耐藥的產生主要與BCR-Abl激酶的突變有關，目前已證實的BCR-Abl突變有15種，包括Y253H、E255V、F359V、T315I等在內，其中T315I在突變中占的比重最大，達20%的耐藥程度，且耐藥程度最高。隨後開發的一係列藥物如博舒替尼、巴菲替尼、塞卡替尼等也都對該突變束手無策。更糟糕的是，如果患者反複使用達沙替尼和尼羅替尼等二代激酶抑製劑（TKI），T315I突變的比例會進一步增加。因此，開發針對T315I突變有效的TKI已迫在眉睫，為克服耐藥性以及毒副作用問題，多種新型Bcr-Abl選擇性抑製劑正在開發中。

本報告所依托的課題就是通過分析已上市的以及開發中的Bcr-Abl抑製劑的化學結構及其與蛋白的結合模式，通過生物電子等排，計算機輔助藥物設計等合理設計方法，設計並合成一係列新型抗T315I突變的Bcr-Abl抑製劑，並與生物學家和藥理學家合作，進行結構優化，構效關係研究，以及藥理、藥代性質等成藥性評價。

1.已上市的治療CML的小分子靶向藥物

1.1伊馬替尼（Imatinib，Glivec®，STI571）

伊馬替尼（商品名：格列衛，化合物名：STI571）是由瑞士諾華公司研發的第一個被批準上市的選擇性酪氨酸激酶小分子抑製劑。伊馬替尼通過競爭性地抑製ATP與Bcr-Abl激酶的結合，阻止Bcr-Abl激酶磷酸化激活，從而抑製CML癌細胞的增殖，並誘導其凋亡。由於伊馬替尼靶向CML癌細胞特有的Bcr-Abl激酶，療效顯著，副作用小。臨床研究表明，伊馬替尼能使95%的慢性期病人，53%的加速期病人以及15%的急變期病人得到完全血液學緩解。於2001年5月，獲美國FDA加速審批通過上市。上市後作為治療CML的一線藥物應用於臨床，用藥病人平均5年生存率達88.7%。伊馬替尼的成功證明了采用合理藥物設計，分子靶向的，治療特定疾病（特別是癌症）的藥物開發策略是切實可行的。為藥物研發提高療效，降低副作用指明了方向。

然而，隨著伊馬替尼在臨床上的廣泛應用，耐藥性問題日益凸顯：部分CML病人對伊馬替尼天然耐受；另一部分病人在用藥一段時間後，產生獲得性耐藥。在伊馬替尼用藥42個月後，16%的慢性期病人、大部分加速期和急變期病人產生耐藥而複發。耐藥的主要原因是Bcr-Abl激酶的突變所導致的ATP口袋形狀及電性的改變阻礙了伊馬替尼的結合。目前已發現的Bcr-Abl激酶點突變達一百多種，其中T315I突變在突變中占的比重最大。

1.2尼羅替尼（Nilotinib，Tasigna®，AMN107）

尼羅替尼是瑞士諾華公司為克服伊馬替尼耐藥問題所開發的第二代酪氨酸激酶抑製劑。於2007年被FDA批準作為CML二線治療藥物上市，用於治療伊馬替尼耐藥或不耐受的費城染色體陽性CML。在2010年6月被批準作為一線藥物，用於治療新發病例。對於野生型Bcr-Abl，尼羅替尼表現出比伊馬替尼強20倍的細胞抑製活性，而且尼羅替尼對於大部分的伊馬替尼耐藥突變型有抑製作用。然而，對主要突變T315I尼羅替尼無顯著抑製作用。

1.3達沙替尼（Dasatinib，Sprycel®，BMS-354825）

達沙替尼是美國百時美施貴寶公司開發的Src/Abl雙靶點抑製劑。與伊馬替尼和達沙替尼隻抑製非活化態（DFG-out）Bcr-Abl激酶不同，達沙替尼不僅能抑製非活化態激酶，而且能抑製活化態（DFG-in）激酶。其對野生型Bcr-Abl激酶的抑製活性是伊馬替尼的325倍和尼羅替尼的16倍，且對除T315I外的大部分突變保持抑製作用。2006年，FDA批準達沙替尼作為二線藥物上市，治療對於伊馬替尼耐藥或不耐受的CML病例。2010年10月，經FDA批準成為治療CML的一線藥物。

1.4博舒替尼（Bosutinib，Bosulif®，SKI-606）

博舒替尼是Bcr-Abl/Src/Stat-5抑製劑，2011年由輝瑞公司在歐洲上市，用於治療慢性期CML。在臨床試驗中，用藥24周，有31%的病人獲得主要細胞學緩解。平均用藥24.2個月後，86%的病人獲得完全血液學緩解，53%的病人獲得主要細胞學緩解（其中41%獲得完全細胞學緩解）。用藥兩年，有79%的病人無病情惡化，92%的病人存活。博舒替尼對大部分的Bcr-Abl突變型有效，但對T315I無效。2012年，美國FDA批準了該藥的上市，作為二線藥物用於治療其他抑製劑耐藥或不耐受的慢性期、加速期及急變期的費城染色體陽性CML。

1.5普納替尼（Ponatinib，Iclusig®，AP24534）

基於良好的ADME性質以及臨床試驗數據，普納替尼已作為抗耐藥Bcr-Abl抑製劑，於2012年12月，獲FDA加速審批上市，用於治療耐藥或不耐受的CML和費城染色體陽性急性淋巴細胞白血病（Ph+ ALL）。普納替尼是目前上市藥物中唯一能抑製Bcr-Abl T315I突變型的抑製劑。

2.抗T315I突變類的CML治療藥物研究

2.1什麼是T315I突變

“守門人”殘基蘇氨酸，是在多種酪氨酸激酶中常見的，位於激酶催化域旁的重要殘基。它控製著小分子抑製劑進入活性口袋的通路。在Bcr-Abl激酶中，315位的蘇氨酸突變為異亮氨酸，稱為T315I（Threonine to Isoleucine at 315 position）突變。

2.2T315I突變導致耐藥

在使用伊馬替尼治療失敗的CML病人中，有15~20%檢測到了T315I突變。早期研究認為，T315I突變對伊馬替尼耐藥的機製是由於突變後減少了一個與藥物作用的氫鍵並增大了藥物與伊馬替尼的位阻作用。然而，最新分子動態模擬研究表明，氫鍵個數的減少並不是T315I伊馬替尼耐藥的主要原因，為適應突變殘基而發生的蛋白構象調整才是導致伊馬替尼親和力下降的主要因素。

2.3針對T315I突變的CML治療藥物研究

目前，上市藥物中，隻有最新上市的普納替尼能抑製該突變。其它該突變抑製劑尚在開發中（進入臨床的抗T315I突變Bcr-Abl抑製劑活性及分類見表1-1）。

表1-1.進入臨床的抗T315I突變Bcr-Abl抑製劑

結合口袋	抑製劑	IC50（nM）		臨床試驗階段	臨床試驗號
野生型	T315I 突變型
活性構象 ATP口袋	PHA-739358	21	2	II期	NCT00335868
VX-680	10	30	終止	NCT00405054
AT9283	<5	<5	終止	NCT00522990
非活性構象 ATP口袋	Ponatinib	0.37	2	上市	NCT01207440
變構口袋	Rebastinib	5.8	7.9	I/II期	NCT00827138

3、開發中的CML小分子靶向治療藥物的小分子靶向藥物

雖然尼羅替尼，達沙替尼和博舒替尼成功提高了對野生型Bcr-Abl激酶的抑製活性，並能有效抑製對大部分伊馬替尼耐藥的突變型。然而，對於位於激酶口袋入口的，占所有突變15%~20%的T315I突變卻束手無策。目前，除剛上市的普納替尼外，沒有其它上市藥物能夠有效抑製T315I突變型。各大製藥公司競相開展了多項藥物研發工作（大部分針對T315I突變型），下麵簡單介紹已進入臨床試驗階段的Bcr-Abl抑製劑。

3.1PHA-739358

PHA-739358（Danusertib，Jonsson Comprehensive Cancer Center）為吡咯並吡唑類化合物，PHA-739358最初由輝瑞公司開發，意圖是作為激酶Aurora A、B和C的抑製劑，治療多發性骨髓瘤。最新研究表明，PHA-739358能夠抑製野生型Bcr-Abl激酶，並且對T315I突變型的抑製活性達5nM。通過對其與Bcr-Abl T315I突變型激酶的共結晶研究表明，PHA-739358適應了異亮氨酸至蘇氨酸的突變，結合於活化態激酶的ATP口袋。2006年，PHA-739358進入臨床二期試驗，用於治療包括T315I突變型在內的CML。

3.2VX-680

VX-680（Tozasertib，MK-0457，Merck）是另一個被發現有Bcr-Abl激酶活性的Aurora激酶抑製劑，對野生型以及T315I突變型Bcr-Abl的IC₅₀分別為10 nM and 30 nM。蛋白晶體學研究表明，VX-680亦結合於活化態Bcr-Abl激酶。2006年，VX-680進入臨床I/II期試。但由於其具有引起心髒QTc間期延長的副作用，目前已暫停臨床試驗。

3.3 AT9283

AT9283^12b（Astex Pharmaceuticals）能有效抑製T315I突變型Bcr-Abl激酶（IC₅₀< 5nM），同時也是Aurora A/B、JAK2和JAK3的抑製劑。計算機分子模擬研究表明，AT9283可與活化態Bcr-Abl T315I突變型激酶結合，競爭性地抑製ATP與激酶的結合，從而抑製其活性。2007年，AT9283進入臨床I/II期試驗。2013年，在臨床II期試驗中被FDA推薦終止試驗。

3.4巴菲替尼

巴菲替尼（Bafetinib，INNO-406）是Bcr-Abl/Lyn雙激酶抑製劑。目前由CytRx Oncology公司進行臨床II期研究，用於治療B細胞慢性淋巴細胞白血病，轉移性前列腺癌和惡性膠質瘤。發明人Nippon Shinyaku亦研究了INNO-406在CML病人中的療效，19%的CML病人獲得主要血液學緩解，對加速期和急變期的病人無效。對多種突變有效，但對T315I突變無效。

3.5Rebastinib

Rebastinib（DCC-2036，DP-1919.TO，Deciphera Pharmaceuticals LLC）是由Deciphera公司開發的非ATP競爭型Bcr-Abl小分子抑製劑，作用於活化態以及非活化態的Bcr-Abl激酶的變構口袋，用於口服治療慢性粒細胞白血病和急性淋巴細胞白血病。在Ba/F3細胞增殖試驗中，Rebastinib能有效抑製野生型以及T315I突變型Bcr-Abl細胞，IC₅₀分別為5.8 nM和7.9 nM，而對正常Ba/F3細胞無顯著影響。且每天服用Rebastinib能顯著延長Ba/F3 T315I感染的Balb/c小鼠的生存期，口服100mg/kg能抑製Abl和STAT5的磷酸化超過8小時。由於良好的生物活性以及安全性的支持，Rebastinib於2009年進入臨床I/II期試驗。

3.6 CR-4

CR-4（LS-10）是酪氨酸激酶Jak2和Bcr-Abl的選擇性小分子抑製劑。化合物在The Hospital for Sick Children發現，並由AEgera開發。CR-4不是ATP競爭性抑製劑，因此可能抑製由於ATP口袋突變導致的耐藥。但活性數據並未見報道。2008年，CR-4進入臨床I期研究。