單堿基編器是近年才出現的新基因編輯係統,被認為是基因編輯技術3.0版本。該係統的基本原理是基於脫氨酶的作用,將胞嘧啶(C)轉變為胸腺嘧啶(T)(Cytidine base editors, CBEs),或將腺嘌呤(A)轉變成鳥嘌呤(G)(adenine base editors, ABEs),這種堿基間的相互轉換,不會引起雙鏈DNA的斷裂,利用其進行基因編輯,更加有效而又安全。而較早期的Cas9等基因編輯工具均會伴隨DNA斷裂,後者會造成基因組的不穩定性,對被編輯的生物機體帶來安全隱患。

　　單堿基編輯器出現以後,很快被廣泛地運用於動物、植物和人細胞的基因編輯。但是,以往的研究主要集中在單位點的堿基突變。而人類遺傳性疾病以及動物遺傳性狀改變往往涉及到多個位點的單堿基突變,因此,對基因組的多個位點進行單堿基編輯才更有可能培育出能夠模擬人遺傳性疾病的大動物模型和擁有優良遺傳性狀的畜禽新品係。

　　該研究利用BE3和A3A-BE3兩種單堿基編輯工具,在細胞和胚胎層麵,對基因組進行三基因單堿基編輯,每個基因設計一條gRNA,突變成終止密碼子或者突變誘導新的mRNA剪切位點。在胎胚上,三基因同時被編輯效率最高可達50%。而細胞層麵,三基因同時編輯最高可達25%。在很多動物體內存在有內源性逆轉錄病毒,這種基因係列相同的內源性病毒往往以多拷貝的形式分布於染色體的不同位點。而豬內源性病毒的存在,給豬作為異種移植器官供體帶來安全隱患。本研究還對與豬內源性病毒複製有關的pol基因進行了單堿基突變,製造提前的終止密碼子,從而實現單基因的多位點失活。通過二代測序分析,可以看到在體細胞內,多拷貝的敲除率達到80%以上,而在胚胎層麵,71%病毒拷貝得到敲除。因此,本研究證明,單堿基編輯係統在細胞和胚胎水均可實現多基因或單基因多位點的高效堿基突變。

　　本研究進一步通過胚胎注射以及體細胞核克隆的途徑分別培育出了單基因突變豬和多基因突變豬。所獲得含有單基因突變的杜氏肌肉營養不良症(Duchenne muscular dystrophy, DMD)豬模型以及早衰症(Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome, HGPS)豬模型,均極好地模擬了病人的表型。所獲得的與免疫細胞發育相關的三基因(RAG1、RAG2、IL2RG)純合突變豬的胸腺和脾髒發育有明顯缺陷,T細胞、B細胞及NK細胞缺失,免疫細胞不能進行V(D)J基因組重排,具有典型的重症免疫缺陷表型。由於豬的免疫係統與人非常相似,這種重症免疫缺陷豬模型將成為生物醫藥研究領域的重要基因修飾工具豬。

　　該論文的共同通訊作者為賴良學研究員以及王可品副研究員。廣州生物醫藥與健康研究院博士研究生謝精科、葛維凱、栗楠、劉琪帥為共同第一作者。研究工作得到中國科學院戰略先導專項、國家重點研發計劃、國家自然科學基金、廣東省實驗室、廣東省及廣州市科技計劃、中國科學院青年創新促進會等項目的支持。