iPS克隆豬

美國培育出的轉基因豬

豬對人類做出的貢獻的確巨大

　　誕生於1996年7月5日的“克隆羊”多莉，曾被美國《科學》雜誌評為“1997年世界十大科技進步”的第一項，也是當年最引人矚目的國際新聞之一。科學家認為，“多莉”的誕生標誌著生物技術新時代的來臨。最近幾年基因編輯技術發展突飛猛進。如今，科學家已開始利用基因編輯技術改造豬的器官，結合克隆動物技術培育能夠為人類捐獻器官的豬，用以治療一些晚期器官功能衰竭疾病。

　　科學技術的發展，已在逐漸克服各種異種器官移植的難題。如果有一天，你的器官已經衰竭，無法再支持你的生命，你不必苦苦等待那1%的器官移植機會，為你量身打造（基因編輯）的豬器官將為你帶來新生。

1、豬是人類器官 最理想的供體對象　

　　自20世紀80年代免疫抑製藥物應用以來，臨床器官移植就成為晚期器官功能衰竭的首選治療手段。但器官來源在全世界範圍內一直存在嚴重短缺的問題，人們便想到可以從動物身上來尋找相關器官來源。無論從倫理學、繁殖特性、傳染病風險、器官大小和生理學等多方麵考慮，豬都是人類器官最理想的供體對象。

　　隻是，豬器官植入人體，存在的一個最大障礙是超急性排斥反應。因此，避免該反應便是異種器官移植的關鍵。

　　非靈長類動物的細胞表麵有一種被稱為是α-1,3半乳糖（即α-Gal）的抗原，在長期的生命進化中，α-Gal在靈長類包括人體中已經消失，但卻有針對該抗原決定簇的天然抗體。所以，如果將其它動物的器官和組織移植入靈長類動物，其內在抗體與外來組織器官細胞表麵的α-Gal相結合，會引發補體係統的鏈式激活，能夠在幾十分鍾到數小時之內將外來的移植物殺死。這就產生了“超急性排斥反應”。

　　最初，人們試圖通過一般的轉基因技術，生產能降低或掩蓋半乳糖基轉移酶活性的轉基因豬，但效果不明顯。隻有培育出完全不含α-Gal的轉基因豬，才能徹底消除這種排斥反應。自從2002年，賴良學所在的美國研究團隊克服了體細胞基因打靶技術和體細胞核移植技術兩大技術障礙，成功獲得世界首例“半乳糖基轉移酶基因敲除的克隆豬”，美國哈佛大學醫學院又利用該“半乳糖苷轉移酶雙基因敲除克隆豬”的器官，移植到狒狒體內。腎髒移植後狒狒存活了83天，另一隻心髒移植後的狒狒存活長達6個月（該結果先後發表於《Nature Medicine》上）。隨後十幾年裏，科學家們在“半乳糖苷轉移酶雙基因敲除豬”的基礎上，對豬開展了多基因修飾，以降低人體對豬器官的免疫排斥，豬器官在非人靈長類動物體內的存活時間也越來越長。

　　今年4月，《Nature Communications》發表了美國國家衛生研究院異種豬心髒移植的突破性進展。該研究小組在“半乳糖苷轉移酶基因敲除純合子豬”的基礎上，又獲得了一種“三基因修飾轉基因豬”。科學家將該轉基因豬的心髒移植到狒狒體內，輔助抗體藥物治療，最終使異種豬心髒在狒狒體內平均存活298天，其中一隻活了945天，創造了異種器官移植的新紀錄。

　　在異種移植領域有一個共識是，如果豬器官在狒狒身上能夠存活一年，就可以開展豬器官的人體移植實驗。因此，豬心髒移植入人體的臨床實驗指日可待。

2、異種胰島移植或最先應用臨床

　　早在上世紀20年代，醫學界就發現了胰島素的功能。一開始，科學家在狗的身上發現了胰島素和能夠產生胰島素的胰島，就覺得它非常有趣——平時不活躍，但一旦周圍環境中葡萄糖濃度提升，胰島就會分泌胰島素來調控身體各個器官和組織代謝、分解葡萄糖。有了這一理論的支撐，生物醫藥界、化學界一直在為糖尿病患者尋找最合適的胰島素來源。

　　胰島隱藏在胰腺內，體積微小僅150-400微米大小。人類的胰腺含有75萬-200萬個胰島，經過提純後一般隻能保留20萬- 50萬個胰島。

　　上世紀50年代，英國科學家最早測定了牛胰島素的全部氨基酸序列，開辟了人類認識蛋白質分子化學結構的道路。1965年9月17日，中國科學家人工合成了具有全部生物活力的結晶牛胰島素，它是第一個在實驗室中用人工方法合成的蛋白質。但牛的胰島素與人類自身胰島素存在著三個氨基酸的差異，因此效價較低，用於治療時需要更大的劑量，且更容易產生藥物依賴(胰島素越打越多)。

　　進入21世紀，生物醫學技術，已經能夠直接產業化生產人胰島素。但即便是產生出了足夠劑量的胰島素，依然存在著諸多問題。比如使用短效胰島素，吃了飯就要打一針；長效胰島素，需要一天打兩針，等等。而且患者患病越久，使用的劑量往往越大。所以，從捐獻者處獲得人類胰島進行移植，早在1977年就開始嚐試了。截至2012年，全世界一共有1400人接受了人胰島同種異體移植，但移植成功率也就隻有58%的水平。胰島移植本身在技術上沒有什麼難度，與其他器官移植如肝移植、腎移植相比，胰島移植屬於細胞移植，移植風險也相對微小。隻是胰島器官來源非常有限。

　　來源於人類的胰島捐獻太過稀少，醫學界就將目光投向了其它動物。比如同為哺乳動物的豬、牛等。它們與人類在基因層麵的相似度非常高，超過80%。具體到胰島、胰島素層麵，差異就更加小。來自中國、新西蘭的醫生一直在進行動物源性的胰島移植研究。比如中南大學湘雅附三院的王維課題組對22例施行“豬-人”胰島移植的糖尿病患者進行複查，結果顯示：手術後20例患者的胰島素使用量減少了30%以上，屬“有效”；其中6例減少了50 %以上，達“顯著療效”，其中1人脫離胰島素達一周之久，為“暫時治愈”。這一研究的關鍵在於，直接移植豬的胰島，生物安全性問題並沒出現。用了豬胰島的患者，也並沒有因此更容易得豬流感或更容易感染豬鏈球菌。隻是這種治療糖尿病的效果仍不如人胰島移植，畢竟兩者存在一個氨基酸的差異。

　　近日，湘雅醫院有關團隊又將誘導免疫耐受新技術應用到了豬胰島異種治療糖尿病，達到了非常接近人同種異體胰島移植臨床療效。該研究獲得的“純合子人源化胰島素基因修飾豬”，將為糖尿病的治療提供人胰島素，同時也將為臨床異種胰島移植治療提供更為理想的供體來源。目前，賴良學研究團隊也正通過克隆技術和正常的動物繁育技術加快該“人源化胰島素基因修飾豬”的繁殖，嚐試通過修改豬胰島素編碼基因，使其直接編碼生產出人胰島素，期望在2-3年內進行非人靈長類動物的豬胰島移植試驗後正式進行臨床試驗。

3、“基因修飾豬”後代都是“親人豬”　

　　日前，中科院廣州生物醫藥和健康研究院賴良學課題組，在對小豬特定基因進行精準的修飾後，讓該小豬和其子代、孫代出生的小豬都變成了這種能分泌人類胰島素的“親人豬”。

　　在對30-35天的小豬胎兒進行處理後，研究人員可先期得到小豬的成纖維細胞。對獲得的小豬成纖維細胞特定基因進行精準的修飾後，通過克隆技術，用基因編輯後的成纖維細胞替換豬卵子的細胞核，由此就能生成的新的豬克隆胚胎細胞，然後再植入到母豬的輸卵管中。剩下的懷孕、分娩工作，就由小豬的母親自己完成。

　　要滿足醫學臨床試驗用途，還需要擴大繁殖這一種類的豬群。畢竟一個I型糖尿病患者進行的胰島移植，可能需要20頭左右的小豬來提供。隻有擴大繁殖後，無論是用這些豬來生產人胰島素也好，還是隻提純豬的胰島用來進行胰島移植手術也好，都會更加便利。

　　這一技術還在後續研究中，下一步，研究人員希望能夠在猴子這一靈長類動物身上進行基因編輯豬胰島的移植試驗。然後有望在5年內進入臨床試驗，隨後進入臨床應用。目前該課題組的相關研究已在線發表在國際知名的《分子細胞生物學雜誌》上。

　　其實現代醫學發現，人類所有的遺傳性疾病中，大多數疾病屬於明確的基因點突變疾病。在明確了發病原理後，科學家們已經能通過豬等其他生物來模擬人類的疾病了。通過基因編輯技術，甚至可以讓豬也患上地中海貧血、帕金森、衰老等疾病，然後利用這些患“人病”的豬替人試藥，最終選出有效的治療藥物和治療策略，反過來治人病。這就是“模式生物”在為現代醫學界選藥過程中發揮的巨大作用。

　　（本文來源：中科院廣州生物醫藥與健康研究院）

漸凍人症相關的研究——漸凍豬　

　　早前流行一時的“冰桶挑戰活動”，就是為呼籲全世界關注“漸凍人”而發起的。肌萎縮側索硬化症，俗名就是“漸凍人症”，是一種無法治愈而且致命的神經退行性疾病。患者在臨床上表現為上、下運動神經元混合受損，導致球部、四肢、軀幹、胸部和腹部的肌肉僵直、顫搐並逐漸萎縮，最終患者因吞咽和呼吸困難而死亡。

　　目前已知的漸凍人症的致病基因主要為SOD1、TDP-43、FUS等。然而，轉基因小鼠模型的研究一直難以模擬病人這一典型的病理變化。中科院廣州生物醫藥與健康研究院賴良學課題組與中科院遺傳與發育生物學研究所李曉江研究組，利用體細胞核移植的方法，曾成功地建立“轉基因亨延頓舞蹈症豬”和“轉入突變SOD1基因的漸凍人症豬”模型。

　　後來，他們合作建立了“轉基因TDP-43西藏小型豬”模型。該轉基因豬表現出“漸凍人”的症狀，同時存在類似人類疾病患者中神經細胞質TDP-43聚集的現象。此研究不僅揭示了TDP-43的新型致病機理，也提示大動物模型更能表現出與病人病理變化較為接近的特征。

相關人體實驗仍未獲批準　

　　華爾街時報最新消息稱，在美國，已有超過12萬人在等待著器官移植，卻沒有足夠的捐獻者。這種嚴重的短缺讓研究人員將一個不尋常的解決方案提上日程：用轉基因豬提供器官用於人體移植。

　　其實這項異種移植的研究已進行了幾十年。去年美國哈佛大學一組科研人員發表論文稱，他們使用一種新的基因編輯技術CRISPR-Cas9，已能基本敲除豬基因中的病毒殘餘物質。因此，如今甚至有消息稱，美國有可能明年就會開始在人體上進行相關實驗。

　　但國際異種移植協會今年更新了聲明，說在進行人體臨床實驗之前，已獲得改良的轉基因豬的胰島的異種動物，至少需要存活六個月或更長的時間。他們當然希望第一名參與實驗的病人就能獲益，但畢竟我們還不知道豬基因裏是否還攜帶某些未知病毒，可能對豬無害，或者對其它動物也無害，卻可能會感染人類。目前美國食品和藥物管理局對啟動人體臨床試驗這一申請的態度仍是保守的：這種異種移植最多隻能限於那些患有某些疾病嚴重至危及生命的人，前提還應該是其他治療方式已不足以對其進行醫治。

　　不過參與相關研究的Tector博士說，對於一些年紀較大的患者來說，可能在去世前都等不到一個相匹配的可供移植的器官，那麼嚐試移植一個轉基因豬的器官也未嚐不是一件好事。（那拉）　　

第一頭克隆豬的誕生　

　　鏈接

　　由於豬的生理特征、組織細胞結構和人類十分類似，因此豬等大動物的基因修改、誘導多能性幹細胞（iPS）等研究受到世界各國科學家的重視。

　　2002年，賴良學所在的美國研究團隊成功獲得世界首例“半乳糖基轉移酶基因敲除的克隆豬”。這是全世界第一頭“基因敲除豬”（或稱“基因打靶豬”）。2011年，任職於中科院廣州生物醫藥與健康研究院的賴良學博士、浙江大學肖磊博士和華大基因研究所杜玉濤博士等的共同努力下，賴良學課題組又率先獲得了全世界第一頭的成活的“iPS克隆豬”。

　　獲得基因打靶的iPS細胞之後，一方麵可以通過嵌合體技術，獲得生殖係嵌合的動物，再經過交配獲得“基因修飾動物”；另一方麵，可將這些基因打靶iPS細胞為核供體，通過核移植技術獲得“基因修飾克隆動物”。賴良學通過長期開展人和動物胚胎幹細胞的分離培養、轉基因動物的建立、動物克隆及人類治療性克隆等研究，已發表相關論文100餘篇，並成功地建立了30餘種在生物醫藥和農業領域具有重要用途轉基因豬。□李小平

　　原載於《羊城晚報》（2016年12月03日 B4版 晚會）