iPS克隆豬

研究團隊成員合影

　　本報記者　張建列　通訊員　黃博純

世界上首次獲得了iPS克隆豬，為基於iPS進行基因修飾大動物的製作打通了技術路線；首次將鋅指核酸酶介導的基因打靶技術應用於豬基因修飾，使豬體細胞打靶效率由10-6提高到4%，實現了對大動物高效基因打靶；首次將2A序列介導的多基因轉移技術應用於豬基因組修飾，成功獲得了四色熒光豬，並實現了多個外源基因在動物體內的高效協同表達……這些原創成果出自betway体育下载 聯合南方醫科大學、浙江大學、深圳華大基因研究院等完成的項目《豬基因突變技術創新及基因修飾豬模型的建立》，該項目組在大動物基因修飾技術方麵所取得的突破及所獲得的動物模型，將進一步促進基因修飾大動物作為生物醫藥模型的研究，推動生物醫藥業的發展，並由此獲2015年度廣東省科學技術獎一等獎。

豬是更理想的人類疾病模型

　　人類疾病動物模型作為人類疾病的“複製品”，可按研究者的需要隨時采集各種樣品或分批處死動物收集標本，以了解疾病全過程，這是臨床難以辦到的。項目的第二完成人、betway体育下载 副研究員樊娜娜介紹，人類疾病的動物模型是指各種醫學科學研究中建立的具有人類疾病模擬表現的動物，包括小鼠、豬、狗等，主要用於實驗生理學、實驗病理學和實驗治療學（包括新藥篩選）研究。“與人類完全相同的動物自發性疾病模型畢竟不可多得，往往需要人工加以複製。為了盡量做到與人類疾病相似，首先要注意動物的選擇。”

　　從基因角度上看，豬與人類基因的相似性達到83%，因此豬在醫學研究上有很大前景。樊娜娜說，小鼠與人在心血管係統、神經係統、營養代謝等方麵與人體差異較大，用做人類疾病模型時不能準確反映人類疾病；小鼠體型小、壽命短不適合進行一些治療技術開發和長效研究。“比如，因為豬與人類生理比較接近，我們可以讓豬得人類的疾病，進而探討治療方法，這比將小鼠作為模型動物要可靠得多。

　　“小鼠研究模型有很多種，也很成熟，但和人的差異比較大，不能完全反映人的情況。炎症反應小鼠和人是不同的，前幾年美國曾經上市一種治療糖尿病的藥品，在小鼠實驗的效果非常理想，然而用到人身上卻副作用非常大，最終這個藥被撤了。現在美國FDA審批藥物上臨床治療時，要求有大動物模型實驗後，才能用到人上。”

　獲得世界首例iPS克隆豬

　　豬的生理特征、器官組織結構和人類比較類似，特別是豬的肝髒、心髒等器官與人類的相似性也很高，科學家們一直在尋找將豬作為人源化器官培養體的方式。樊娜娜說，這一切都需要製備基因修飾豬。自2007年起，在項目的第一完成人、betway体育下载 研究員賴良學的帶領下，項目組聚焦大動物基因修飾技術研究及基因修飾動物模型的建立工作。

　　樊娜娜介紹：“目前來說轉基因豬製備包括隨機轉基因和基因打靶兩種方式，其中：隨機轉基因豬是把外源基因放到豬裏麵，讓豬表達它自己沒有的基因；基因打靶是把某個基因放到豬基因的特定位置，想對豬的哪個基因進行突變或修飾都可以。基因打靶包括兩種功能：一是基因敲除，即把某個基因去掉，二是基因敲入，是把某個基因放到基因組的某一個地方。”

　　但是，由於缺乏豬胚胎幹細胞，轉基因豬的製備主要依賴於體細胞基因修飾和體細胞核移植技術。這種技術用來進行隨機轉基因豬的製作無壓力，但是由於體細胞打靶效率極低，對豬進行基因定點修飾非常困難。這成了研究中最大的瓶頸。各國科學家都希望通過豬的iPS（誘導多能幹細胞，induced pluripotent stem cells）來克隆豬，但未能獲成功。“iPS的出現為大動物基因打靶提供了新的希望。獲得基因打靶的iPS細胞之後，一方麵可以通過嵌合體技術，獲得生殖係嵌合的動物，經過交配獲得基因修飾動物；另一方麵，可將這些基因打靶iPS細胞為核供體，通過核移植技術獲得基因修飾克隆動物。”

　　在不懈努力下，項目組發現外源基因的表達和表觀遺傳學可能是影響iPS克隆胚胎發育的主要原因，經過反複的實驗，項目組在2011年獲得世界上第一個成活的iPS克隆豬。iPS來源克隆豬的成功，為基於iPS 進行基因修飾豬的製作打通了技術路線。克服了以體細胞進行基因修飾存在的體外增殖能力有限，打靶效率低的難題。

大動物領域，基因打靶技術國際領先

　　如何提升豬的打靶效率？樊娜娜表示，“以前大動物上沒有胚胎幹細胞（ES），體細胞打靶效率極低，在小鼠上能做的東西大動物上做不到，或者說能做但很難做，所以我們做不過齧齒類動物。但是近十年，隨著鋅指核酸酶基因打靶技術、TALENs基因敲除技術、CRISPR/Cas9基因敲除技術等興起，這幾種新的基因打靶技術的出現使大動物的基因定向修飾變得非常容易，通過這幾種技術現在我們可以在大動物上實現基因打靶了。”

　　2008年，鋅指核酸酶基因打靶技術被開發出來，“當時我們項目組立即跟進，將該技術應用於豬胎兒成纖維細胞進行基因打靶，使體細胞打靶效率由10-6 提高到4%；確立了以鋅指核酸酶基因打靶技術對胎兒成纖維進行打靶後再進行核移植的高效基因打靶豬製作技術路線。樊娜娜坦言，獲獎項目隻是針對鋅指核酸酶基因打靶技術的應用，但是項目組一直沒有停步，一直緊跟基因打靶技術的前沿，在TALENs基因敲除技術和CRISPR/Cas9基因敲除技術等當前先進基因修飾技術在大動物基因修飾應用領域，項目組也處於國際的領先水平。

　　“目前來說，國內外在轉基因、基因打靶方麵技術基本上與國際是同步的，但這些技術都不是我們國內科學家發現的，而把這些技術應用到大動物領域並取得重大研究成果我們是占據了領先位置。”

促進豬模型在生物醫藥的應用研究

　　據悉，通過實施該項目，項目組在Cell Research、Human Molecular Genetics等雜誌上發表論文5篇，其中發表在Human Molecular Genetics的論文被選為封麵文章刊出。論文被SCI數據庫論文總引用149次，他引115次，單篇最高引用49次，他引42次。項目在大動物基因修飾技術方麵所取得的突破及所獲得的動物模型將進一步促進基因修飾大動物作為生物醫藥模型的研究，推動生物醫藥業的發展，具有巨大的社會效益和經濟效益。

　　“目前，我們建立了多種人類疾病模型豬、器官移植模型豬、基礎研究工具豬模型等。其中，我們建立的人類亨廷頓疾病模型豬表現出與人類亨廷頓舞蹈症患者腦中類似的神經細胞凋亡現象，這在亨廷頓疾病模型中是首次見到。”樊娜娜解析說，亨廷頓疾病是遺傳性神經退行性疾病，影響肌肉的協調性，導致認知功能減退和精神問題。豬的大腦結構與人更為接近，適合用於人退行性神經疾病的研究。“亨廷頓疾病模型豬已列入亨廷頓疾病協作組，對全世界亨廷頓疾病研究團隊開放使用，以促進亨廷頓疾病治療研究，《豬基因突變技術創新及基因修飾豬模型的建立》項目的完成推動了我國大動物模型研究工作，促進了豬這一大動物模型在生物醫藥領域的應用研究。”

　　樊娜娜也坦言，這些人類疾病模型豬還處於發展的初期。目前，這些模型做出來了但是還沒有得到大規模的應用，這裏有多方麵的原因：一是沒有相應的高標準的飼養條件，如無病原飼養室，如免疫缺陷型模型豬對病源無抵抗力，在普通飼養環境中不能長期存活；另外，對豬行為學、影像學的研究缺少完善的評價體係，導致很多模型無法廣泛應用，這些評價標準還需要實驗動物行為學的專業人員參與製定。

基因修飾豬應用未來大有前途

　　豬作為重要的經濟動物是人類生活關係最為密切的家畜之一，轉基因豬在農業領域中應用廣泛。可以對豬的基因進行改造，提高豬肉產量，改善豬肉的質量，增加豬肉的營養價值等，也可以提高豬的抗病能力。樊娜娜還舉了一個例子，比如糖尿病人，是不能吃糖的。“但是可以將一種糖味蛋白基因轉到牛身上，讓這個基因在乳腺中表達，那麼這種牛產出的奶就是有甜味。這種牛奶的甜味不是來自糖而是來自蛋白，這樣糖尿病人就可以吃到有甜味的牛奶了。”

　　豬在解剖、組織、生理和營養代謝等方麵均與人類最接近，在生物醫藥方麵，可以進行異種器官移植，即把豬的器官移植到人身上，比如把豬的腎髒、心髒、胰髒、角膜等往人身上移。在此之前，賴良學研究員及其合作者曾經將超級性排斥相關基因敲除後的豬心髒移植到狒狒身上，並成功最終存活了6個月左右。樊娜娜說，豬器官移植到人體，阻礙異種器官移植工作獲得成功的首要問題是免疫學上的排異反應問題，再就是豬的內源性病毒。“豬的內源性病毒是整合在豬的基因組內的，對豬是沒有影響，但是豬器官移植到人體，病毒可能會被激活，讓人感染得病。目前我們項目組正在把這些病毒基因敲掉。”

　　目前幹細胞技術發展很快，更大膽的展望是人源化器官的實現，“讓豬體內長出人的器官。”樊娜娜解釋說，將來把人的幹細胞放到器官缺陷豬的早期胚胎中，這樣豬就可以長出人的器官，這就是人源化器官，在此之前有日本科學家在小鼠身上長出大鼠的胰髒，說明人源化器官的預想是可實現的，這也是未來大有前途的研究領域。在賴良學研究員的帶領下，項目組目前已經在開展人源化器官的研究工作。

　　來源：《廣東科技報》4月22日特別報道